β-榄香烯是从我国传统中药姜科植物温郁金（温莪术）中分离提取的倍半萜类天然产物，已被证明对多种肿瘤有效，为国家二类抗肿瘤药物，其市场规模超过40亿人民币。
目前β-榄香烯的生产方式主要是植物提取，具有培养周期长、受环境影响大、难以纯化等诸多问题，难以实现稳定的供应。而通过微生物细胞工厂生产β-榄香烯离工业应用还有很大距离。
近日，大连化物所周雍进团队以多形汉逊酵母（Ogataeapolymorpha）为宿主，通过优化甲羟戊酸途径、增加NADPH和乙酰CoA的供应以及下调竞争途径实现了β-榄香烯的高水平生产。工程菌株在分批发酵和补料分批发酵下分别产生mg/L和4.7g/L的β-榄香烯。相关文章以题“GlobalmetabolicrewiringofthenonconventionalyeastOgataeapolymorphaforbiosynthesisofthesesquiterpenoidβ-elemene”发表于MetabolicEngineering。博士研究生叶敏为本文第一作者，周雍进研究员为通讯作者。
多形汉逊酵母是一种用于蛋白质表达的非模式工业酵母，具有许多优点，例如耐热性、底物谱广和发酵密度高。研究人员表示，这项工作证明了多形汉逊酵母作为底盘细胞生产倍半萜类和其他乙酰CoA衍生化学品的潜力。
（来源：MetabolicEngineering）
综合来看，研究团队通过系统地优化甲羟戊酸途径（MVA途径），以及加强辅因子NADPH和前体乙酰CoA的供应，探索了多形汉逊酵母生产β-榄香烯的潜力。这也是工程化多形汉逊酵母来生产倍半萜类化合物的首次尝试。
▲图丨在非模式酵母多形汉逊酵母中生产β-榄香烯的路径工程示意图（来源：MetabolicEngineering）
第一部分，优化MVA途径。
酵母本身存在MVA途径，该途径的产物可以看作是活化的异戊二烯单位，是类固醇、类萜等生物分子的合成前体。
GermacreneA是β-榄香烯的前体，可以通过体外一步化学反应转化为β-榄香烯。GermacreneA由GermacreneA合成酶催化法尼基焦磷酸(FPP)环化而来，FPP是通过MVA途径合成的，所以应优化MVA途径以提高β-榄香烯的产量。
为了找到最合适的GermacreneA合成酶，研究人员对已被报道的几种GermacreneA合成酶进行比较，结果表明，LsLTC2在β-榄香烯生产方面表现最好。
▲图丨通过调节MVA途径加强β-榄香烯的生产（来源：MetabolicEngineering）
接着，这一合成酶基因被整合到多形汉逊酵母Ku80ΔL的基因组中，整合后的LsLTC2在最小培养基中培养72小时后，β-榄香烯滴度最高达到19mg/L。因此，该基因被应用于进一步的研究。
根据前人的研究，倍半萜合酶与Erg20的融合形成了将FPP转化为倍半萜的直接通道，同时最大限度地减少FPP的竞争性消耗。
于是，团队通过连接子GGGGS构建了两者的融合体，由此所得的融合体β-榄香烯滴度比通过单独的基因表达得到的要高得多。
然后，为了系统地优化MVA途径，研究人员仔细评估了该途径上的每个基因，试图加强MVA途径的每个步骤。
首先，团队将MVA途径中的限速基因转变为其在细胞质中更稳定的截断形式tHMGR，并利用强组成型启动子控制其过量表达，令人惊讶的是，此时仅观察到转变为其在细胞质中更稳定的截断形式tHMGR，并利用强组成型启动子控制其过量表达，令人惊讶的是，此时仅观察到轻微的产量增加。
其次，ERG10和ERG13被过量表达以驱动更多的碳通量进入MVA途径，结果使β-榄香烯的滴度增加了35%，这也表明上游HMG-CoA供应是多形汉逊酵母生物合成类异戊二烯（β-榄香烯的合成单元）的瓶颈。
团队还发现，参与IPP和DMAPP之间异构化的基因IDI1的过量表达，明显增强了β-榄香烯的含量。这表明IPP和DMAPP之间的平衡对倍半萜的生产至关重要。
第二部分，加强NADPH和乙酰CoA的供应。
异戊二烯的生物合成需要足够数量的辅助因子NADPH作为驱动力；乙酰CoA作为倍半萜类化合物的关键组成部分，它的供应对于高效生产至关重要。
团队通过加强磷酸戊糖途径（PPP）来增加NADPH库；通过引入PK(phosphoketolase)和PTA(phosphotransacetylase)两种酶来重新连接PPP通量并合成更多的乙酰CoA。
并且通过PK和PTA的融合表达以及删除特定基因避免了类似于酿酒酵母中的乙酸盐的积累（乙酸盐是乙酰辅酶A生产的前体）。与亲本菌株相比，PK和PTA的融合表达略微增加了β-榄香烯的产量，而GPP1的删除在前者的基础上进一步提高了β-榄香烯的产量11.4%。
▲图丨增强NADPH和乙酰CoA对β-榄香烯生产的供应（来源：MetabolicEngineering）
第三部分，下调ERG9表达，调控转录因子。
在增加主要途径的代谢通量的同时，研究人员还通过降低竞争途径来减少FPP的消耗。
其中，ERG9将FPP转化为角鲨烯用于甾醇的合成，然而，这一路径不能被完全阻断，因为角鲨烯是细胞膜的一个重要组成部分。
研究人员设想通过促进Erg9的降解来下调角鲨烯的合成。
他们先尝试将已在酿酒酵母中验证的可有效降低麦角甾醇或角鲨烯含量的方法套用至本研究的酵母宿主中，试图通过启动子进行ERG9的动态控制，但这些启动子的效果都不理想。
然后，团队尝试在翻译水平上探索降解肽?CLN2PEST下调Erg9。首先从酿酒酵母中克隆?CLN2PEST基因，该基因与Erg9融合显著提高了β-榄香烯的产量。
▲图丨ERG9下调调控β-榄香烯的产生和UPC2-1的表达（来源：MetabolicEngineering）
最后，通过在摇瓶中进行分批补料发酵，以及优化发酵条件，最大限度地提高β-榄香烯产量，最终实现工程菌株在分批发酵和补料分批发酵下分别产生mg/L和4.7g/L的β-榄香烯。
近年来，将非常规微生物作为细胞工厂的工程受到广泛