项目管理求职招聘微信群 http://liangssw.com/bozhu/12746.html文章题目：Autophagy-inducedp62accumulationisrequiredforcurcumoltoregulateKLF5-mediatedangiogenesisinliversinusoidalendothelialcells
发表期刊：Toxicology影响因子（IF）：4.DOI:10./j.tox..文章主题：本论文首次发现了莪术醇能够通过调控细胞自噬水平抑制LSEC病理性血管新生过程；进一步研究发现莪术醇可以降低转录因子KLF5表达水平，且探索出可能是由于莪术醇通过抑制自噬导致自噬底物p62积累，进而促进p62与KLF5的结合促进KLF5发生蛋白酶体降解。
该图揭示了莪术醇可通过调节肝纤维化中自噬介导的KLF5表达来抑制病理性血管生成的机制。
结果展示：
莪术醇可防止LSECs的病理性血管生成
（A）HIF-1α和促血管生成因子（n=3）的蛋白质印迹和光密度分析；（B）实时荧光定量PCR分析HIF-1α和促血管生成细胞因子（n=3）的mRNA表达；（C）Transwell迁移测定法，用于评估LSEC迁移（放大倍，比例尺=20μm）；（D）评估管形成实验并用图像J（n=3）计数。
莪术醇在体外降低了LSEC的自噬活性
（A，B）蛋白质印迹和自噬小体形成和关键自噬基因的定量分析（n=3）；（C，D）LC3和关键自噬基因（n=3）的mRNA的实时PCR分析；（E）蛋白质印迹技术和自噬途径相关因素的光密度分析（n=3）；（F）通过将用绿色（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）在N末端标记的含LC3-II的质粒转染经姜*酚处理的LSEC中来评估自噬通量。使用用于GFP和RFP的标准滤光片组，在Olympus荧光显微镜上的×20透镜下观察图像；（G）使用透射电子显微镜（TEM）分析显示用20μM姜*酚处理的LSEC中自噬体和自溶酶体减少。
自噬的激活损害莪术醇抑制的LSEC体外血管生成
（A）用Ad-GFP-LC3B转导的LSEC的代表性共聚焦图像；（B）ATG5过表达质粒（n=3）效率的蛋白质印迹分析；（C）HIF-1α和促血管生成因子表达的蛋白质印迹分析（n=3）；（D）Transwell迁移测定法，用于评估LSEC的迁移，图像J用于计算每个视野中迁移细胞的数量；（n=3）（E）用图像J评估管形成实验并计数（n=3）。
莪术醇抑制LSEC血管生成所需的KLF5减少
（A，B）使用Western印迹和实时PCR分析检查KLF5的表达（n=3）；（C）通过免疫荧光分析检测KLF5。VEGF-A处理后，用KLF5过表达质粒或siRNA转染LSEC，然后用DMSO（0.02％，w/v）或20μM姜*素处理24小时；（D）通过Western印迹技术在KLF5质粒和KLF5siRNA处理的LSEC中HIF-1α和促血管生成因子的表达；（E）Transwell迁移测定法，用于评估LSEC的迁移；图像J用于计算每个视野中迁移细胞的数量。（F）用图像J评估管形成实验并计数。
p62的积累是自噬调节KLF5降解和LSEC血管生成的必要条件
（A，B）使用蛋白质印迹和实时PCR分析来评估在用ATG5质粒处理的LSEC中KLF5的表达程度；（C，D）应用Western印迹和实时PCR分析检查姜*素处理过的LSECs中p62的表达；VEGF-A处理后，用p62siRNA转染LSEC，然后用DMSO（0.02％，w/v）或20μM姜*素处理24小时。（E）通过western印迹法检测p62siRNA转染的LSEC中KLF5的水平；（F）共免疫沉淀试验用于证明p62和KLF5的相互作用；（G）使用激光共聚焦显微镜观察p62和KLF5的共定位。
体内实验莪术醇可减轻肝纤维化
（A）肝组织的代表性照片，肝切片用苏木精和曙红，Masson试剂和Sirius红染色；（B）分析血清ALT，AST，ALP水平；（C）检测小鼠血清中LDH含量；（D）在小鼠血清中测定HA，LN，PC-III和IV–C的水平。
莪术醇通过调节小鼠自噬介导的KLF5表达来改善血管生成
（A）肝切片中vWF，CD31和CD34表达的免疫化学染色；（B）肝组织中内皮标志物CD31，CD34，vWF和血管生成细胞因子VEGF-A和VEGFR-2的蛋白质印迹分析；（C–F）通过免疫荧光双重染色技术检测内皮标记物CD31与KLF5，ATG5，VEGF-A和p62在肝切片中的共定位。
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