什么治白癜风 http://pf.39.net/bdfyy/bdfzg/190710/7288900.html摘要：目的利用模式生物斑马鱼研究姜*Curcumalonga抗血管新生作用，并采用网络药理学和分子对接技术探究姜*抗血管新生的作用机制。方法采用模式生物斑马鱼模型，考察姜*挥发油、姜*素以及姜*水提液对斑马鱼节间血管生长的抑制作用，检测各给药组斑马鱼节间血管生成数，计算血管生成抑制率。利用网络药理学和分子对接技术预测姜*抗血管新生的作用机制，构建“药物-成分-靶点”网络和蛋白质-蛋白质相互作用（protein-proteininteraction，PPI）网络，进行基因本体（geneontology，GO）富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）通路富集分析；通过AutoDockvina软件对活性成分与关键靶点进行分子对接验证。结果姜*挥发油、姜*素以及姜*水提液均可明显抑制斑马鱼血管新生（P＜0.05），呈剂量相关性，其中姜*素抑制血管生成作用最强。网络药理学预测发现姜*共有21种主要活性成分，可通过调节前列腺素G/H合酶2（prostaglandinG/Hsynthase2，PTGS2）、维生素D3受体（vitaminD3receptor，VDR）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threoninekinase1，AKT1）和血清白蛋白（albumin，ALB）等关键靶点，进而调控磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositide3-kinases，PI3K）-AKT和血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）等相关信号通路，从而发挥抑制血管新生的作用。分子对接结果显示姜*的主要活性成分与核心靶点均能自发结合。结论姜*挥发油、姜*素以及姜*水提液对斑马鱼血管新生的抑制作用存在差异，姜*抗血管新生具有多成分、多靶点、多途径的特点，为姜*对血管新生依赖性疾病的防治提供了参考。
血管新生是指在原有血管的基础上构建新血管的过程。在正常生理状况下，体内抗血管与促血管因子之间呈动态平衡；当机体受到过度促血管因子刺激时，会导致异常的过度的病理性血管新生。病理性血管新生是人类恶性肿瘤、心血管疾病和其他疾病发生发展的重要进程[1]，癌症、糖尿病视网膜病变、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎等70余种疾病均与血管过度生成有关，因此抗血管新生的研究对于治疗血管新生依赖性疾病具有重要意义[2]。传统中医药理论虽无“血管新生”这一概念，但《素问·脉要精微论》提出“脉”为气血运行之通道，其中络脉主血、入血伤络，可见血管新生相关疾病与中医络脉的病变密切相关，中医临床上多选用活血化瘀类中药治疗络脉病变[3]。因此，中药治疗病理性血管新生具有一定的理论依据和优势。
姜*为姜科植物姜*CurcumalongaL.的干燥根茎。姜*属植物的药用记载始于《唐本草》[4]，姜*性辛，味苦、温，入脾、肝经，可破血行气、通经止痛，用于治疗胸胁刺痛、胸搏心痛、痛经经闭、癥瘕、风湿肩臂疼痛、跌扑肿痛等症[5]。现代药理学研究表明，姜*具有抗炎、调血脂、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等作用[6-7]。姜*素和挥发油类成分为姜*中的主要活性成分，姜*素能够通过上调微小核糖核酸-（microRNA-，miR‐），负调控血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositide3-kinases，PI3K）-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threoninekinase，AKT）和酪氨酸激酶2/信号传导及转录激活因子5A（Januskinase2/signaltransducerandactivatoroftranscription5，JAK2/STAT5）信号通路，从而发挥抗动脉粥样硬化作用[8]，还能够通过影响miR-及miR-的靶基因VEGFB和核转录因子-кB（nuclearfactor-кB，NF-кB）表达，减少角膜内血管生成[9]。姜*挥发油成分β-榄香烯能够下调原发性黑色素瘤中血管生成标志物CD34表达，抑制肿瘤生长[10]。
斑马鱼是辐鳍亚纲鲤科的一种热带硬骨鱼，原产于南亚地区[11]。由于其基因组序列与人类具有87%的高度相似性，胚胎透明且实验周期短，被广泛应用于药物研究[12]。flk1-EGFP转基因斑马鱼常用于心脏、节间血管、脑血管系统等研究，荧光显微镜下血管的内皮细胞呈绿色荧光，可以直接观察斑马鱼血管的生成情况，是一种便捷的抗血管新生的体内研究模型[13]。本研究以转基因荧光斑马鱼为模式生物，探究姜*抑制斑马鱼胚胎血管新生的作用，并通过网络药理学构建“药物-成分-靶点”网络，结合分子对接技术，以整体性、系统性的角度阐释姜*抗血管新生的作用机制，为姜*防治血管新生依赖性疾病的药效物质基础提供科学依据。
1材料
1.1动物
转基因型flk1-EGFP品系斑马鱼，购自国家斑马鱼资源中心，由成都中医药大学药学院斑马鱼实验平台培养和繁殖。
1.2药材
姜*饮片（批号）购自成都荷花池中药材专业市场春宇药堂，经成都中医药大学马云桐教授鉴定为姜科植物姜*C.longaL.的干燥根茎。
1.3药品与试剂
姜*素（批号wkq）、去甲氧基姜*素（批号）、双去甲氧基姜*素（批号wkq）、芳姜*酮（批号wkq）、莪术醇（批号wkq）购自四川省维克奇生物科技有限公司，质量分数均≥98%；二甲基亚砜（DMSO，批号C）购自上海麦克林生化科技有限公司；链霉蛋白酶（批号X）购自北京索莱宝科技有限公司；VEGF受体酪氨酸激酶亚群抑制剂PTK（批号，质量分数为99.97%）购自美国MedChemExpres公司；MS-、甲基纤维素购自美国Sigma公司。
1.4仪器
斑马鱼培育与繁殖系统（北京爱生科技发展有限公司）；恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；SMZ-型体视显微镜、SMZ-型荧光显微镜（日本Nikon公司）。
2方法
2.1姜*抗斑马鱼血管新生作用
2.1.1供试品溶液的制备
（1）姜*挥发油溶液的制备取姜*药材粉末（过2号筛）g，采用水蒸气蒸馏法提取姜*挥发油成分，以含0.1%DMSO的胚胎培养水作为溶剂，分别配制成质量浓度为、50、25、10、1μg/mL的姜*挥发油溶液。
（2）姜*素溶液的制备取姜*素1mg，以含0.1%DMSO的胚胎培养水作为溶剂，分别配制成质量浓度为、50、25、10、1μg/mL的姜*素溶液。
（3）姜*水提液的制备取姜*药材粉末（过5号筛）1mg，加10倍量水，回流提取1h，滤过，以含0.1%DMSO的胚胎培养水作为溶剂，分别配制成质量浓度为、50、25、10、1μg/mL的姜*水提液。
（3）PTK溶液的制备精密称定PTK，以含0.1%DMSO的胚胎培养水作为溶剂，分别配制成质量浓度为0.、0.、0.、0.μg/mL的PTK溶液。
2.1.2姜*挥发油溶液和姜*水提液的质量控制
（1）气相色谱-质谱联用（GC-MS）法测定姜*挥发油成分取姜*药材的挥发油μL，用正己烷稀释50倍，定容至5mL量瓶，经0.45μm微孔滤膜滤过，注入气相色谱仪进行测定[14]。
（2）混合对照品溶液的制备精密称定姜*素、去甲氧基姜*素、双去甲氧基姜*素、莪术醇、芳姜*酮于5mL量瓶中，加甲醇振摇后定容，得到质量浓度为0.、0.、0.、0.、0.g/L的混合对照品溶液。
（3）超高效液相色谱（UPLC）双波长法（nm、nm）测定姜*水提液成分取姜*药材粉末（过5号筛）1g，加10倍量水，回流提取1h，经0.45μm微孔滤膜滤过，注入超高效液相色谱仪进行测定[15]。
2.1.3分组与给药取受精后24h的斑马鱼胚胎，采用链霉蛋白酶（0.1mg/mL）脱膜，随机分为对照组、姜*挥发油组、姜*素组、姜*水提液组和PTK组，置于含药液的24孔板中，每孔10～15粒胚胎，每孔终体积为1.5mL，培养板于28℃恒温培养箱中培养24h。
2.1.4指标观察采用0.%MS-麻醉斑马鱼胚胎，调整斑马鱼姿势，使两侧眼、体节重合，采用体式荧光显微镜进行血管表型观察，然后于3%甲基纤维素中固定并拍照。观察完整体节间血管（intersegmentalvessel，ISV）和缺陷ISV的形态，以评估姜*的抗血管生成活性，根据体节间血管生成数目计算抑制率。
血管生成抑制率＝(对照组血管生成数－给药组血管生成数)/对照组血管生成数
2.1.5数据处理采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析，结果以表示。
2.2基于网络药理学和分子对接探究姜*抗血管新生的作用机制
2.2.1姜*主要成分和靶点的筛选基于中药系统药理学技术平台（TCMSP），以口服生物利用度＞30%且类药性＞0.10为筛选条件，对姜*的成分进行筛选，同时结合相关文献，确定姜*的主要成分。采用TCMSP数据库及PharmMapper服务器（
